前言

光是調(diào)控植物生長發(fā)育的重要環(huán)境因子，植物通過不同的光受體感知不同波長的光從而調(diào)節(jié)植物的光形態(tài)建成、開花時間和晝夜節(jié)律等生理生化過程。CRY1通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄活性或轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性來抑制藍光激發(fā)下的下胚軸伸長，這反過來又調(diào)節(jié)了下游光反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄和表達。m6A修飾在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育中同樣起著重要作用，然而，人們對其潛在的機制卻知之甚少，并且m6A是否以及如何調(diào)節(jié)光控制的光形態(tài)建成目前尚不清楚。

(相關(guān)資料圖)

2022年10月28日，湖南大學(xué)生命學(xué)院趙小英/何崇圣團隊在New Phytologist期刊（IF：10.323）發(fā)表了題為“The blue light receptor CRY1 interacts with FIP37 to promote N6-methyladenosine RNA modification and photomorphogenesis in ”的研究論文，報道了CRY1（ Cryptochrome 1，隱花素1）可通過與FIP37（甲基轉(zhuǎn)移酶）互作，在藍光激發(fā)下增強FIP37與RNA的結(jié)合能力，從而增加光形態(tài)建成相關(guān)基因的m6A修飾，降低這些RNA的穩(wěn)定性，進而促進光形態(tài)建成，為CRY1在調(diào)控植物生長的分子作用機制提供新的見解。

研究內(nèi)容

本研究通過Dot blotting實驗發(fā)現(xiàn)藍光能誘導(dǎo)RNA m6A修飾水平升高，而cry1突變體中的m6A修飾降低，表明CRY1參與調(diào)控藍光誘導(dǎo)m6A修飾過程。進一步研究發(fā)現(xiàn)藍光可部分通過CRY1調(diào)節(jié)甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體成員FIP37基因的表達；在藍光下，突變體幼苗下胚軸伸長對藍光的敏感性減弱，幼苗下胚軸變長，表明FIP37正調(diào)節(jié)藍光介導(dǎo)的光形態(tài)建成。進一步探究該現(xiàn)象背后的機制發(fā)現(xiàn)，CRY1與FIP37直接互作，在藍光激發(fā)下，CRY1能夠增強FIP37與RNA的結(jié)合能力。已有研究報道發(fā)現(xiàn)突變體中光形態(tài)建成負調(diào)節(jié)子PIF3、PIF4和PIF5的mRNA水平升高，m6A修飾水平下降。

在本研究中，作者通過m6A測序比較了和突變體中m6A修飾的差異基因，同時通過實驗發(fā)現(xiàn)在藍光激發(fā)下，CRY1與FIP37能夠提高和 mRNA的m6A修飾水平，進而影響這些基因的mRNA的穩(wěn)定性。因此，該研究提出了一種新的機制，即CRY1可通過與FIP37互作，在藍光激發(fā)下增強FIP37與RNA結(jié)合的能力，從而增加光形態(tài)建成相關(guān)基因的m6A修飾，降低這些RNA的穩(wěn)定性，進而促進光形態(tài)建成。

技術(shù)路線

研究結(jié)果

1. CRY1介導(dǎo)了藍光誘導(dǎo)的光形態(tài)建成中m6A修飾積累和m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶（Writers）FIP37的表達

Dot blotting實驗驗證了藍光誘導(dǎo)下的擬南芥幼苗總RNA m6A水平顯著高于紅光或遠紅光誘導(dǎo)的幼苗（圖1a），而在突變株中m6A水平降低（圖1b），在藍光長時間處理后立即升高（圖1c），并隨著藍光強度的升高而升高（圖1d），但突變株的升高水平仍低于野生型，表明藍光誘導(dǎo)的m6A修飾需要CRY1的參與，但這種過程可能也有其它如CRY2藍光受體的參與。為驗證藍光誘導(dǎo)的這種m6A積累是否是m6A Writers的表達調(diào)控所導(dǎo)致，作者通過qPCR發(fā)現(xiàn)在連續(xù)藍光下生長的幼苗中，野生型中m6A Writers基因和的表達水平均高于黃化幼苗，突變株中的表達水平稍高于黃化幼苗但顯著低于野生型（圖1e）。此外，在藍光誘導(dǎo)3h內(nèi)，野生型和突變株中的表達量分別增加2.6倍和1.6倍，但突變株的表達量也明顯低于野生型（圖1f），最后作者發(fā)現(xiàn)在藍光下，F(xiàn)IP37蛋白水平升高，在黑暗下，F(xiàn)IP37蛋白水平降低（圖1g-i），表明藍光在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平都激活了的表達。

圖1 ICRY1介導(dǎo)藍光誘導(dǎo)的m6A甲基化和m6A Writer基因FIP37的表達

2. FIP37參與了藍光介導(dǎo)的對下胚軸伸長的抑制

為確定m6A修飾在光形態(tài)建成中的功能作用，作者分析了突變體在不同光照條件下的下胚軸表型，與野生型植株相比，突變體在藍光激發(fā)下表現(xiàn)出更長的下胚軸，但在紅光、遠紅光或黑暗條件下表現(xiàn)出正常細長的下胚軸（圖2a-b），提示FIP37參與了藍光對下胚軸伸長的抑制；此外，在相對較高強度的藍光處理下，突變體的下胚軸伸長對藍光的敏感性降低，表現(xiàn)出更長的下胚軸長度（圖2c-d），并且通過使用恢復(fù)株系進行下胚軸實驗證明這種表型在互補后可得到挽救，表明FIP37參與了藍光介導(dǎo)的下胚軸伸長。

圖2 |fip37突變體的下胚軸伸長對藍光的敏感性降低

3.CRY1與FIP37相互作用

BiFC、pull down和Co-IP實驗分別從體內(nèi)體外證實CRY1與FIP37以不依賴藍光的方式發(fā)生相互作用（圖3a-d），其中，pull down結(jié)果表明CRY1的CNT1和CCT1結(jié)構(gòu)域均可與FIP37 N端發(fā)生相互作用，而非C端（圖3e-g），表明FIP37的N端非結(jié)構(gòu)域是介導(dǎo)其與CRY1相互作用的主要區(qū)域。

圖3 | CRY1與FIP37相互作用

4. 藍光增強了FIP37與RNA的結(jié)合能力

據(jù)報道，F(xiàn)IP37在體內(nèi)可與mRNA結(jié)合，作者通過RIP實驗發(fā)現(xiàn)FIP37蛋白可以結(jié)合RNA，并且在藍光處理下FIP37蛋白能結(jié)合更多的RNA（圖4a-b），表明在體內(nèi)和體外藍光均增強了FIP37與RNA的直接或間接結(jié)合。進一步探究CRY1在此過程中的作用時發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，GST-FIP37與突變體結(jié)合的RNA較少，而GST-FIP37與GFP-CRY1結(jié)合的RNA更多（圖4c），表明CRY1參與了藍光誘導(dǎo)的FIP37-RNA相互作用。

圖4 ICRY1是FIP37在藍光下與RNA結(jié)合所必需的

5. CRY1和FIP37調(diào)控PIF3、PIF4和PIF5的表達和m6A修飾

為了探究FIP37是否可以與任何光形態(tài)建成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本直接結(jié)合，作者選擇了表達量和m6A修飾均受藍光和CRYs調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子和，發(fā)現(xiàn)它們在和突變體中轉(zhuǎn)錄本的表達均有所增加（圖5a），表明CRY1和FIP37抑制了和的表達。通過RIP-qPCR實驗發(fā)現(xiàn)FIP37在體內(nèi)可與和轉(zhuǎn)錄本結(jié)合，并且在藍光生長的幼苗富集到和轉(zhuǎn)錄本比在黑暗中生長的黃化幼苗多（圖5b）。進一步通過m6A-IP-qPCR檢測了FIP37和CRY1對和的影響，結(jié)果顯示在和突變體中，和轉(zhuǎn)錄本的m6A修飾均減少（圖5c），表明CRY1和FIP37調(diào)控了和的m6A修飾。測量在藍光下和 轉(zhuǎn)錄本的衰減率發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，在和突變體中，和轉(zhuǎn)錄本的衰減速度延遲（圖5d），表明CRY1和FIP37在藍光誘導(dǎo)下介導(dǎo)的m6A修飾作用加速了和轉(zhuǎn)錄本的衰減，使得這些轉(zhuǎn)錄本的表達量下調(diào)。

圖5 |CRY1和FIP37調(diào)控PIF3、PIF4和PIF5的mRNA衰減

6.FIP37位于CRY1的下游

通過進一步比較CRY1過表達植株和FIP37突變體植株在不同強度藍光下的下胚軸長度發(fā)現(xiàn)：過表達的植株的下胚軸比野生型的植株要短，幼苗比過表達植株長，但在低強度藍光和和高強度藍光條件下比野生型短（圖6），表明突變可以部分挽救Myc-CRY1過表達植株的短下胚軸表型。因此推測FIP37很可能在藍光抑制下胚軸伸長的過程中作用于CRY1的下游。

圖6 | fip37突變可以部分挽救cry1過表達幼苗的短下胚軸表型

研究總結(jié)

本研究首次發(fā)現(xiàn)FIP37調(diào)控與藍光相關(guān)的光形態(tài)建成，證明CRY1可通過與FIP37發(fā)生相互作用，在藍光激發(fā)下增強FIP37與RNA結(jié)合的能力，從而增加光形態(tài)建成相關(guān)基因如和的m6A修飾，降低這些RNA的穩(wěn)定性促進其轉(zhuǎn)錄本衰減，進而促進光形態(tài)建成。

歐易生物在本研究中承擔(dān)了RNA甲基化測序（m6A-Seq）和生信分析工作。

圖7 | 在擬南芥中調(diào)控藍光相關(guān)光形態(tài)建成的CRY1-FIP37模型

原文鏈接：

https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/nph.18583

DOI:10.1111/nph.18583